کنترل میانی سمپلر

کنترل میانی سمپلرها

کنترل کيفيت سمپلر( ميکروپيپت ):

اطمينان از درستی کاليبراسيون ميکرو پيپت ها که ازطريق بررسي دقت و صحت عملکرد ميکرو پيپت در برداشت حجم مورد انتظار حاصل می گردد، نقش مهمي در برنامه هاي تضمين کيفيت ايفاميکند. اگرچه  اين ارزيابي  به دو روش توزين و رنگ سنجي قابل انجام است، ولي تحت شرايط موجود و به علت عدم دسترسي اغلب آزمايشگاهها به الزامات استفاده از روش توزين مانند ترازوهايي با درجه تفكيك (Resolution) مناسب براي كنترل سمپلر (درجه تفکيک  01/0 ميلي گرم ) و کاليبراسيون منظم ترازو  استفاده از  روش رنگ سنجي، توصيه مي‌گردد.

بررسي دقت و صحت سمپلر می بایست حداقل  3 تا 4 بار در سال انجام شود.

بررسی میانی سمپلر (ميكروپيپت) به روش رنگ سنجي

در اين روش با استفاده از يك محلول رنگي با جذب پايدار، مثل رنگ سبز خوراكي در طول موج 630-620 نانومتر و يا پارانيتروفنل در طول موجهاي 401 يا 405 نانومتر ، صحت عملكرد سمپلر  ونيز قابليت تکرار آن  كنترل مي شود.

مواد و ابزار مورد نياز :
1ماده رنگي  :
  • رنگ سبز خوراکي  يا  پارانيترو فنل

Paranitrohenol (C6H5NO3), indicator PH (5.4-7.5) MERCK Art. 6798

جذب نوري بدست آمده از پودر پارانيتروفنل (انديكاتور) استفاده شده در اين دستورالعمل با مقادير قيد شده براي High purity- NIST SRM 938 Paranitrophenol مندرج در كتاب Tietz 1999  قابل انطباق است.

2-  هيدروکسيد سديم  01 / 0 نرمال : محلول کاري براي رقت سازي پارانيترو فنل .

.  Sodium hydroxide (NaOH), Pure … MERCK Art. 6462

3- لوازم شيشه اي کلاس A  با توجه به حجم مورد نياز در تهيه غلظت محلول رنگي(از قبيل بالن ژوژه و پيپت )

4- فتومتر داراي طول موجهاي 401 يا  405 براي پارانيترو فنل  و 620يا 630 نانومتر براي رنگ سبز خوراکي

5- لوله آزمايش

6- ترازو ( کاليبره و تحت کنترل )

7- نوک سمپلر مناسب

8- آب مقطر

نکته : طول موج انتخابي براي قرائت محلول پارانيتروفنل 401 نانومتر است ولي امكان قرائت در 405 نانومتر نيز وجود دارد.

روش كار :

همانطور که گفته شد انجام روش رنگ سنجي با استفاده از پودررنگ سبز خوراکي و نيز پارانيتروفنل امکانپذير ميباشد، لذا نحوه تهيه محلول ذخيره (stock)  هردو ماده رنگی بشرح ذیل می باشد .قابل ذکر است درسالهاي اخير رنگ سبز خوراکي بعضا” بصورت ناهمگون و يا محلول  عرضه شده که در اين موارد، دستورالعمل زير کاربرد نداشته و بهتر است از پارانيترو فنل استفاده شود.

بطور معمول سمپلرها به سه گروه    الف) 1000-100 ميكروليتر ،     ب) 100-10 ميكروليتر  

 پ) حجمهاي كمتر از 10 ميكروليتر،  تقسيم مي شوند.

 براي هريک از گروههای فوق می‌بايست بايد يك محلول ذخيره رنگ (stock) تهيه نمود . از آنجايي که اغلب فتومترها بهترين عملکرد خود را در  محدوده جذبي 4 /0  نشان ميدهند محلول هاي ذخيره رنگي با غلظتي تهيه ميشوند که پس از مرحله رقيق شدن  داراي جذبي در حدود 4/0 باشند.

طرز تهيه محلول رنگي ذخيره رنگ سبز خوراكي:

برای هریک از گروهای سمپلری بیان شده محلول ذخبره رنگی جداگانه تهیه می شود

سمپلرهاي گروه الف (1000-100 ميكروليتر):   5/15 ميلي گرم پودر رنگ سبز خوراکی در 100 ميلي ليترآب مقطر حل شود.( غلظت رنگ در محلول ذخيره اين گروه، 5/15ميلي گرم درصد است)

سمپلرهاي گروه ب ( 100-10 ميكروليتر):  155 ميلي گرم پودر رنگ سبز در 100 ميلي ليتر آب مقطر حل شود.( غلظت رنگ در محلول ذخيره اين گروه، 155ميلي گرم درصد است)

سمپلرهاي گروه پ ( سمپلرهاي کمتر از 10 ميکروليتر) : 55/1 گرم از پودر رنگ سبز در 100 ميلي ليتر آب حل شود. (غلظت رنگ در محلول ذخيره اين گروه 55/1 گرم درصد يا1550ميليگرم درصد است)

2 – طرز تهيه محلول رنگي ذخيره پارانيتروفنل براي هر گروه از سمپلرها :

سمپلرهاي گروه الف (1000-100 ميكروليتر): 42 ميلي گرم پودر پارانيتروفنل، در يك ليتر آب مقطر، حل مي‌شود. .( غلظت رنگ در محلول ذخيره اين گروه،  42 ميلي گرم درليتر است)

سمپلرهاي گروه ب ( 100-10 ميكروليتر):  42 ميلي گرم پودر پارانيتروفنل، در 100 ميلي ليتر آب مقطر، حل مي‌شود. .( غلظت رنگ در محلول ذخيره اين گروه، 42 ميلي گرم درصد است)

سمپلرهاي گروه پ ( سمپلرهاي کمتر از 10 ميکروليتر) :  420 ميلي گرم پودر پارانيتروفنل ، در 100 ميلي ليتر آب مقطر، حل مي‌شود. .( غلظت رنگ ذخيره اين گروه، 420 ميلي گرم درصد است)

 بررسی دقت

براي بررسي دقت عملکرد سمپلر و بعبارتي سنجش مقدار عدم دقت يا قابليت تکرار، ابتدا محلول ذخيره  رنگي مناسب طبق روش ذکرشده و باتوجه به حجم سمپلر مورد كنترل، تهيه مي گردد سپس ده لوله در جالوله اي چيده و با استفاده از پي پت كلاس A و بر مبناي  جدول (1-1) مقدار مشخص آب مقطر (در صورت استفاده از رنگ سبز) و يا سود 01/0 نرمال( در صورت استفاده از پارانيتروفنل)، با دقت بسيار زياد  در هر لوله ريخته مي شود.

سپس با استفاده از سمپلر مورد كنترل، از محلول ذخيره رنگي برداشت نموده و به هر لوله اضافه مي شود. پس از مخلوط كردن، ميزان جذب نوري لوله ها در مقابل بلانک مناسب (آب مقطربراي سبز خوراکي و سود براي پارانيتروفنل) قرائت مي‌گردد .همانگونه که قبلا ذکر شد طول موج انتخابي براي قرائت جذب نوري رنگ سبز خوراکي 620 يا630 نانومتر و براي پارانيتروفنل 401 يا 405 نانومتر مي باشد.

توجه  :  در صورت استفاده از محلول ذخيره پارانيترو فنل ، رقتهاي مورد نياز طبق جدول 1-1 بایستی از سود 01/0 نرمال تهيه شود . در حاليکه براي رنگ سبز خوراکي از آب مقطر استفاده مي‌شود.

جدول شماره 1

  گروه سمپلرحجم سمپلر مورد كنترل برحسب ميكروليترآب مقطر يا سود 01/0 نرمال برداشتي توسط پي پت برحسب ميلي ليترحجم رنگ برداشتي از محلول ذخيره توسط سمپلر برحسب ميكروليتر  رقت حاصله
گروه پ5551001/1
گروه ب10110101/1
گروه ب20220101/1
گروه ب255/225101/1
گروه ب50550101/1
گروه ب10010100101/1
گروه الف200220011/1
گروه الف500550011/1
گروه الف100010100011/1

سپس ميانگين و انحراف معيارخوانده هاي جذب نوري(OD ) 10 لوله را مطابق فرمول های زیر محاسبه تا ضريب انحراف آنها را (CV%) بدست ‌آيد.

محاسبه انحراف معیار
 

در صورت انتقال صحيح حجم آب و يا سود ، اختلاف در جذب نوري  لوله هاي حاوي محلول رنگي به اختلاف در حجم برداشت شده توسط سمپلر، نسبت داده  شده و درصد ضريب انحراف خوانده‌ها (CV%)  معرف قابليت تكرار‌پذيري و مقدار عدم دقت سمپلر خواهد بود. 

 ارزيابي صحت

جهت كنترل صحت عملكرد سمپلر و تهيه معيار سنجش صحت در روش رنگ سنجي ، بايد با استفاده از ابزار شيشه اي کاليبره، محلولي داراي رقت مشابه با رقت تهيه شده  توسط سمپلر تهيه شود.

 بدين منظور با پي پت کلاس A، مقداري از محلول رنگي ذخيره (متناسب با  گروه حجمي سمپلر و طبق روش ذيل)، به بالن ژوژه کلاس A اي كه تا خط نشانه از آب مقطر پر شده اضافه ميشود .

روش تهيه محلولهاي کنترل صحت :

كنترل صحت گروه پ ( سمپلرهاي کمتر از 10 ميکروليتر ) رقت 1001/1:

بالن ژوژه يك ليتري را براي سبز خوراكي با آب مقطر و براي پارانيتروفنل با سود 01/0 نرمال  به حجم رسانده سپس با پي پت کلاس A،  ، 1 ميلي ليتر از رنگ ذخيره ( گروه پ ) به آن اضافه و مخلوط نمائيد.

كنترل صحت گروه ب (سمپلرهاي 10-  100   )  رقت 101/1 :  

بالن ژوژه 100 ميلي ليتري را براي سبز خوراكي با آب مقطر و براي پارانيتروفنل با سود 01/0 نرمال به حجم رسانده سپس با پي پت کلاسA ،  ، 1ميلي ليتر از رنگ ذخيره (گروه ب) به آن اضافه و مخلوط نمائيد.

 كنترل صحت گروه الف (سمپلرهاي 100-1000 )  رقت 11/1  : 

بالن ژوژه 100 ميلي ليتري را براي سبز خوراكي با آب مقطر و براي پارانيتروفنل با سود 01/0 نرمال به حجم رسانده سپس با پي پت کلاس A ، 10ميلي ليتر از رنگ ذخيره (گروه الف ) به آن اضافه و مخلوط نمائيد.

نکته : هرگاه براي اضافه کردن 10ميلي ليتر رنگ، در بالاي خط نشانه  فضاي خالي وجود نداشت ، تاجائيکه امکان دارد از حجم 10ميلي ليتر به بالن اضافه نموده و بقيه را به داخل بشر منتقل ميکنيم . پس از مخلوط نمودن کامل محتويات بالن ژوژه ، همه حجم را به بشر اضافه نموده و با محتويات بشر ، بالن ژوژه را چند بار شستشو ميدهيم.

پس از اطمينان از يکنواختي  محلول صحت تهيه شده ، محلول حداقل در سه لوله ريخته و جذب نوري هر سه لوله قرائت مي‌شود. ميانگين خوانده ها بعنوان معيار مقايسه صحت دربررسي صحت عملکرد سمپلر استفاده ميشود .

شاخصه صحت (Bias) است که از فرمول زير بدست مي آيد:

شاخصه صحت

 Expected: ميانگين جذب نوري 3خوانده ازمحلول تهيه شده در بالن ژوژه

Observed: ميانگين جذب نوري 10 لوله که در مرحله ارزيابی عدم دقت بدست آمده است.

توجه : به منظور به حداقل رساندن عوامل ايجاد خطا بهتر است بررسي دقت و صحت در يک روز انجام گيرد.

مقادير مجاز عدم دقت و عدم صحت : 

اولين معيار مقايسه برای کنترل کيفيت سمپلرها، ميزان ادعا شده توسط سازندگان سمپلر برايInaccuracy (Bias) و (CV% )  Imprecisionميباشد  . چرا که بدنبال ارتقاي فنآوري ابزار آزمايشگاهي  و بهبود کيفيت عملکرد ابزار ، مقادير عدم صحت و عدم دقت ادعائي سازند گان ميکرو پيپتها نيز بسيار کاهش يافته است .

 با توجه به مختصات کيفيتي بسياري از ميکرو پيپتها ، حداکثر ميزان قابل قبول عدم دقت

2%  =CV% و حداکثر ميزان قابل قبول عدم صحت3% =Bias%   پيشنهاد ميشود .

نکته: معيارهاي ياد شده که با توجه به تنوع سمپلرهاي مورد استفاده آزمايشگاهها انتخاب شده است، اگرچه از معيارهاي مجاز اعلام شده قبلي کوچکتر ميباشد ولي هنوز با ميزان قابل قبول برخي مراجع بين المللي فاصله زيادي دارد.

تنظيم و تصحيح:

در برخي از انواع سمپلرها که حجم ثابتی را برداشت می‌نمايند(سمپلرهاي Fixed Volume ) در صورت وجود Bias غيرقابل قبول، می‌توان با استفاده از اطلاعات مندرج درراهنماي سمپلر،  حجم  برداشتی را تصحيح نمود.

در مورد تنظيم سمپلرهاي متغير بايد توجه داشت که هرگونه تغيير در حجمهاي مختلف ، به ميزان ثابت اعمال ميشود . بدين معني که تغيير1 ميکرو ليتر در حجم 100ميکروليتر (1% تغيير )، در حجم10 ميکروليتر نيز باعث 1 ميکرو ليتر تغيير (يعني 10%  تغيير) خواهد شد. لذا بهتر است عمل تنظيم کاليبراسيون توسط شرکت معتبر انجام شود.

نحوه نگهداري سمپلر:

نگهداري سمپلر بر اساس دستورالعمل سازنده انجام مي‌پذيرد ولي مطالب ذيل در موردبيشتر انواع سمپلر صادق مي‌باشد.

  • كليه قسمت هاي خارجي اغلب سمپلرها را مي توان با محلول صابون تميز كرد و پس از آبكشي با آب مقطر در دماي اتاق خشك نمود.
  • براي ضدعفوني كردن ، محلول 60% ايزوپروپانل توصيه مي شود. برخی از انواع سمپلر نيز قابل اتوكلاو هستند.
  • پس از شستشوي سطوح خارجي و تميزکردن بخش نگهدارنده نوك سمپلر “Tip holder” (كه به كمك ميله همراه يا با سوآب آغشته به اتانل 70 درجه انجام مي گيرد) بايد پيستون با مقدار كمي از روغن همراه سمپلر،که اغلب Silicone grease ميباشد ، روغن كاري شود.
  • براي تميز كردن قسمتهاي داخلي سمپلر بايد به راهنماي همراه سمپلر مراجعه شود.

نکات مهم :

  1. ضربه به سمپلر مي تواند اين وسيله را از كاليبراسيون خارج نمايد.
  2. با انتخاب سر سمپلر مناسب، حجم محلول برداشتي بايد در حدي باشد كه وارد قسمتهاي داخلي نگردد.
  3. 3-        تماس دست با نوك سمپلر آلوده ممنوع است.
  4. 4-        در صورت مكش محلول هاي  اسيدي و ساير مواد با خاصيت خورندگي بايد بخش نگهدارنده نوك سمپلر (Tip-holder) باز شده و پيستون و حلقه پلاستيكي (O-ring)  بخوبي با آب مقطر شسته شود.
  5. 5-        هرگز نبايد سمپلر حاوي محلول به پهلو روي ميز گذاشته شود.

 هرگز نبايد سمپلرهاي متغير را بر روي حجمي خارج از محدوده حجم ادعائي آن تنظيم كرد

میکرو پیپت

سمپلر یا ميکروپيپت

سمپلر(Sampler) یا ميکروپيپت(Micropipette) چیست؟

میکروپیپت ابزاری آزمایشگاهی می باشد که به منظور جابجایی حجم کوچک مایعات مورد استفاده قرار می گیرد. این وسیله در ایران به نام سمپلر شناخته می شود و در آزمایشگاه های تشخیص طبی و تحقیقاتی، آزمایشگاه های بیولوژی ، سلولی مولکولی و … کاربرد آنها ضروری است. اساس کار این دستگاه کوچک، مکش مایعات و نگهداری آنها تحت فشار خلا و سپس تخلیه در جای دیگر می باشد. حجم مایعی که قادر به جابجایی می باشد از1/0 میکرولیتر (لاندا) تا 10 میلی لیتر متغیر است و بعضی از میکروپیپت ها در حجم های مختلف نیز قابل تنظیم هستند . میکروپیپت های متغیر بسیار محبوب تر از نوع ثابت هستند و باعث صرفه جویی در هزینه میشوند. باتوجه به اینکه بحث در مورد سمپلر های با حجم های بسیار کم است لذا کالیبره کردن آنها اهمیت بسیار بالایی دارد.

روش صحیح استفاده از سمپلر:

پس از محکم نمودن نوک مناسب به سمپلر، ابتدا دكمه كنترل/ فشار (Control button/Push button) سمپلر را به آرامي تا توقف اول دکمه، پائين مي آوريم ، در همان حال نوك را چند ميليمتر(حدود 3 ميلي متر وبسته به حجم سمپلر) در مايع فرو برده و دكمه فشار را به آرامي رها نموده تا مايع وارد نوک سمپلر  شود، براي تخليه در لوله يا ظرف مورد نظر ، با فشار مجدد دكمه تا توقف اول، محلول را با تماس به جداره ظرف به آرامي خارج نموده و پس از 3-1 ثانيه با فشار تا توقف دوم ، باقيمانده محلول را نيز كاملاً خارج می کنیم.

همچنین برای رسيدن به حداكثر دقت و صحت  براي سمپلرهاي با حجم 10 ميكروليتر و بيشتر ، توصيه مي شود قبل از انتقال حجم نمونه ، 2 الي3 بار عمل برداشت و تخليه نمونه تكرار شود تا کاملا” جدار داخلي نوک سمپلر به نمونه آغشته شود سپس حجم مورد نظر از نمونه برداشت گردد.

براي حجم هاي كمتر از 10 ميكروليتر بهتر است، فقط يكبار برداشت با استفادهاز یک نوك سمپلر خشک  (Unwetted Tip) و بدون آغشتگي به نمونه باشد، انجام می شود و پس از تخليه در محل مورد نظر، جهت اطمينان از تخليه کامل تمامي حجم درون نوک سمپلر، با محلول موجود در ظرف شسته شود.

بايد در نظر داشت، عملکرد مطلوب سمپلر فقط با استفاده از سر سمپلر هاي نو و يکبار مصرف بدست مي آيد و از شستشو و استفاده مجدد از سر سمپلرها، می‌بايست خودداری نمود.

نكات مهمي که  در کار با سمپلرمي‌بايست رعايت گردد:

  1.  اطمينان از اتصال کامل نوک آن به سمپلر
  2.  عمود نگهداشتن در زمان مكش
  3. 3-  تخليه محلول با تماس نوك به جداره ظرف تحت زاويه 10 تا 40 درجه
  4. 4-  رها كردن آرام دكمه در زمان پر يا خالي كردن محتويات نوك
  5. 5-  كشيدن كناره هاي خارجي نوك پس از انجام مكش به جداره هاي فوقاني لوله به منظور حذف قطرات خارجي نوک سمپلر يا در صورت نيازخشک کردن قطرات باقي مانده در بخش خارجي آن به كمك پارچه اي بدون پرز(البته بايد مطمئن شد كه پارچه چيزي از محتويات داخل نوك سمپلر را به خود جذب نكند)
  6. 6-   هنگام تخليه محلول پس از توقف اول (پائين آوردن دكمه كنترل تا مرحله اول) بايد كمي تامل كرد (3-1 ثانيه) و سپس دكمه را تا توقف دوم پائين آورد.
  7. 7-  درسمپلرهاي متغير (قابل تنظيم براي حجم هاي مختلف ) توصيه مي شود براي کاهش حجم و تنظيم حجم مورد نظر ، دكمه كنترل به آرامي تارسيدن به حجم انتخابي، چرخانده شود .
میکرو پیپت
میکرو پیپت

براي افزايش حجم بهتر است دكمه كنترل را تا كمي بيش از حجم مورد نظر پيچاند و بعد در خلاف جهت با كم كردن حجم به مقدار مورد نظر رسيد.